本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中有效賴氨酸的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有動(dòng)物或植物性蛋白質(zhì)的配合(混合)飼料及單一飼料。
2引用標(biāo)準(zhǔn)
GB6432飼料粗蛋白測(cè)定方法
3術(shù)語
有效賴氨酸是指在規(guī)定的測(cè)定條件下測(cè)得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。
4原理
蛋白質(zhì)中有效賴氨酸的ε-氨基可與2,4-二硝基氟苯反應(yīng),酸解后生成二硝基苯賴氨酸,而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經(jīng)二硝基氟苯處理的樣品和經(jīng)由二硝基氟苯處理的樣品分別水解,用離子交換色譜法測(cè)定各自的賴氨酸含量,即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。
5試劑和溶液
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純,水為去離子水。
5.1乙醚(HG3-1002)。
5.2碳酸氫鈉(GB640)溶液:80g/L。
5.32.4-二硝基氟苯(DNFB)乙醇溶液:
將一定量的DNFB溶于95%乙醇,其體積比為0.15∶12,該溶液用前現(xiàn)配。
5.4鹽酸(GB622)溶液:6.0mol/L。
5.5鹽酸(GB622)溶液:6.5mol/L。
5.6稀釋用檸檬酸鈉緩沖液:pH約2.2。
將下列試劑依次溶于適量水:
20g水合檸檬酸(HG3-1108)
8g氫氧化鈉(GB629)
16mL濃鹽酸(GB622)
0.1mL辛酸
20mL硫二甘醇
加水稀釋至1000mL。
5.7層析用檸檬酸鈉緩沖液:
pH值及配制方法依不同型號(hào)的氨基酸測(cè)定儀有所區(qū)別,請(qǐng)參見儀器說明書配制。
5.8茚三酮試劑
按儀器說明書配制。
5.9賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液:50nmol/mL或其他濃度。
先配制2.5μmol/mL賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中,稀釋至100mL,混勻。
用該標(biāo)準(zhǔn)貯備液或商品2.5μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液,以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液。也可根據(jù)儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。
6儀器、設(shè)備
6.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī):能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。
6.2樣品篩:孔徑0.25mm(60目)。
6.3分析天平:感量0.0001g。
6.4油。簻囟瓤煞(wěn)定于120~130℃之間。
6.5回流水解裝置:150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器(長(zhǎng)約35~40cm)相接。
6.6離心機(jī):4000r/min。
6.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
6.8氨基酸自動(dòng)分析儀。
6.9回流水解裝置:50mL水解管或消煮管,具磨口接頭與回流冷凝器相接。
6.10金屬塊消煮爐:要求溫度保持在120~130℃之間,必要時(shí)可加繼電器和接點(diǎn)溫度計(jì)控制。金屬塊內(nèi)消煮管的受熱深度應(yīng)高于或等于25mL消煮液的液面高度。
6.11水浴
7試樣制備
采集具代表性的配合(混合)飼料或單一飼料,按四分法縮分制備實(shí)驗(yàn)室樣品,取10~20g粉碎,使其全部通過樣品篩(6.2)。充分混勻,裝入密閉容器。
8分析步驟
8.1A法
8.1.1總賴氨酸
8.1.1.1酸水解
稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品兩份,置于500mL燒瓶(6.5)中,加入250mL鹽酸(5.4),裝好回流冷凝器,置120~130℃油浴(6.4)中,使其徐徐沸騰,回流水解24h。
取下燒瓶,冷卻。必要時(shí)將酸解液(連同水解后不溶物)重新定容至250mL。過濾,吸取5mL濾液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(6.7)上,60℃左右蒸發(fā)至干。加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。
將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),離心10min(4000r/min),取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.1.2測(cè)定
打開氨基酸自動(dòng)分析儀(6.8),使柱溫,反應(yīng)浴溫度,緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數(shù)達(dá)到預(yù)定要求,并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(5.9)進(jìn)行校準(zhǔn)。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。
8.1.2非有效賴氨酸
8.1.2.1二硝基苯化反應(yīng)
稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份,置于150mL燒瓶(6.5)中,加入4mL碳酸氫鈉溶液(5.2),放置10min,其間需不時(shí)振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液(5.3),加蓋,振搖,注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。
8.1.2.2純化
在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上,溫度不高于40℃條件下,將上述反應(yīng)物蒸干,加入35mL乙醚(5.1),振搖或攪拌后,待固體充分沉降,棄去絕大部分乙醚,小心不要帶出固體樣品顆粒。重復(fù)上述操作兩次,每次加25mL乙醚(此步驟乙醚層有時(shí)似較渾濁,只要傾倒時(shí)不帶出樣口顆粒,可不必離心)。最后,蒸發(fā)除去殘存乙醚。
8.1.2.3酸水解
邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸(5.4),使樣品全部浸于酸中,裝好回流冷凝器,置于120~130℃油浴中,使其徐徐沸騰,回流水解24h。
取下燒瓶,冷卻。將水解物定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用水定容,過濾。吸取5mL濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上,60℃左右蒸發(fā)至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。
將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),用離心機(jī)(6.6)離心10min,取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.2.4測(cè)定
同8.1.1.2。
非有效賴氨酸峰值較低,易受鄰峰或雜峰干擾,如某些氨基酸自動(dòng)分析儀該峰分離不好,需將樹脂床(或分析柱)加長(zhǎng),或變換參數(shù)與程序。
8.2B法──簡(jiǎn)化法
8.2.1總賴氨酸
準(zhǔn)確稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品雙份,置于50mL水解管中,加入25mL鹽酸(5.4),裝好回流冷凝器并置于預(yù)先熱至120~130℃金屬塊消煮爐(6.10)上,緩緩煮沸水解24h。
冷卻,將水解液定容至50mL,混勻,過濾。吸取濾液2mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,60℃濃縮至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。
殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6),(粗蛋白質(zhì)含量為10%~20%的樣品加2mL,粗蛋白質(zhì)含量為30%~50%的加5mL),充分溶解后離心,取上清液上機(jī)。
8.2.2非有效賴氨酸
8.2.2.1二硝基苯化反應(yīng)
稱取約含蛋白質(zhì)20~25mg的樣品雙份,置于50mL水解管中,加入2mL碳酸氫鈉溶液(5.2),放置10min(其間不時(shí)振搖),加入DNFB乙醇溶液(5.3)3mL,振搖混勻后,在室溫下暗處放置過夜。
將上述水解管置85~90℃水浴中蒸去乙醇,直至振搖時(shí)不產(chǎn)生泡沫為止。此時(shí)水解管內(nèi)物應(yīng)失重2.5~3g。
8.2.2.2純化
于去醇后的水解管內(nèi)加入2mL乙醚(5.1),加塞,劇烈振搖后令其分層,棄去乙醚層,再用乙醚萃取兩次,每次10mL,棄去醚層后,將水解管放入60~70℃水浴,除去殘存乙醚。
8.2.2.3酸水解
邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸(5.5)裝好冷凝器,與測(cè)總賴氨酸樣品一道置120~130℃金屬塊消煮爐(6.10)上,回流水解24h。
冷卻,將水解液定容至50mL,混勻,過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干,加水少許,重復(fù)蒸干1~2次。
殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液(5.6)(蛋白質(zhì)含量10%~20%加3mL,30%~50%加5mL),充分溶解后離心,取上清液上機(jī)。
9分析結(jié)果的表述
9.1總賴氨酸
樣品中總賴氨酸含量W1,以其質(zhì)量百分率表示,即:
……(1)
式中:A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量,ng;
m1──樣品質(zhì)量,mg;
D──稀釋倍數(shù)。
9.2非有效賴氨酸
樣品中非有效賴氨酸含量W2,以其質(zhì)量百分率表示,即:
……(2)
式中:A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量,ng;
m2──非有效賴氨酸測(cè)定中樣品質(zhì)量,mg;
D──稀釋倍數(shù)。
9.3有效賴氨酸
樣品中有效賴氨酸含量W3,以質(zhì)量百分率表示,即:
有效賴氨酸W3=W1-W2……(3)
若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質(zhì)量百分率表示,則
W3(%)=〔(W1-W2)/W1〕×100……(4)
10重復(fù)性
同一試樣兩平行測(cè)定值的相對(duì)相差,應(yīng)不超過其平均值的10%。
注:與生物測(cè)定法相比,本法測(cè)定結(jié)果偏高,在分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)需加以注意。