1主題內(nèi)容與適用范圍
　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中有效賴氨酸的測(cè)定方法。


　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有動(dòng)物或植物性蛋白質(zhì)的配合（混合）飼料及單一飼料。


　　2引用標(biāo)準(zhǔn)


　　GB6432飼料粗蛋白測(cè)定方法


　　3術(shù)語


　　有效賴氨酸是指在規(guī)定的測(cè)定條件下測(cè)得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。


　　4原理


　　蛋白質(zhì)中有效賴氨酸的ε-氨基可與2，4-二硝基氟苯反應(yīng)，酸解后生成二硝基苯賴氨酸，而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經(jīng)二硝基氟苯處理的樣品和經(jīng)由二硝基氟苯處理的樣品分別水解，用離子交換色譜法測(cè)定各自的賴氨酸含量，即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。


　　5試劑和溶液


　　本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為去離子水。


　　5.1乙醚（HG3-1002）。


　　5.2碳酸氫鈉（GB640）溶液：80g/L。


　　5.32.4-二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液：


　　將一定量的DNFB溶于95％乙醇，其體積比為0.15∶12，該溶液用前現(xiàn)配。


　　5.4鹽酸（GB622）溶液：6.0mol/L。


　　5.5鹽酸（GB622）溶液：6.5mol/L。


　　5.6稀釋用檸檬酸鈉緩沖液：pH約2.2。


　　將下列試劑依次溶于適量水：


　　20g水合檸檬酸（HG3-1108）


　　8g氫氧化鈉（GB629）


　　16mL濃鹽酸（GB622）


　　0.1mL辛酸


　　20mL硫二甘醇


　　加水稀釋至1000mL。


　　5.7層析用檸檬酸鈉緩沖液：


　　pH值及配制方法依不同型號(hào)的氨基酸測(cè)定儀有所區(qū)別，請(qǐng)參見儀器說明書配制。


　　5.8茚三酮試劑


　　按儀器說明書配制。


　　5.9賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：50nmol/mL或其他濃度。


　　先配制2.5μmol/mL賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中，稀釋至100mL，混勻。


　　用該標(biāo)準(zhǔn)貯備液或商品2.5μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液，以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液。也可根據(jù)儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。


　　6儀器、設(shè)備


　　6.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)：能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。


　　6.2樣品篩：孔徑0.25mm（60目）。


　　6.3分析天平：感量0.0001g。


　　6.4油?。簻囟瓤煞€(wěn)定于120～130℃之間。


　　6.5回流水解裝置：150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器（長(zhǎng)約35～40cm）相接。


　　6.6離心機(jī)：4000r/min。


　　6.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。


　　6.8氨基酸自動(dòng)分析儀。


　　6.9回流水解裝置：50mL水解管或消煮管，具磨口接頭與回流冷凝器相接。


　　6.10金屬塊消煮爐：要求溫度保持在120～130℃之間，必要時(shí)可加繼電器和接點(diǎn)溫度計(jì)控制。金屬塊內(nèi)消煮管的受熱深度應(yīng)高于或等于25mL消煮液的液面高度。


　　6.11水浴


　　7試樣制備


　　采集具代表性的配合（混合）飼料或單一飼料，按四分法縮分制備實(shí)驗(yàn)室樣品，取10～20g粉碎，使其全部通過樣品篩（6.2）。充分混勻，裝入密閉容器。


　　8分析步驟


　　8.1A法


　　8.1.1總賴氨酸


　　8.1.1.1酸水解


　　稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品兩份，置于500mL燒瓶（6.5）中，加入250mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器，置120～130℃油?。?.4）中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。


　　取下燒瓶，冷卻。必要時(shí)將酸解液（連同水解后不溶物）重新定容至250mL。過濾，吸取5mL濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（6.7）上，60℃左右蒸發(fā)至干。加水少許，重復(fù)蒸干1～2次。


　　將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），離心10min（4000r/min），取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。


　　8.1.1.2測(cè)定


　　打開氨基酸自動(dòng)分析儀（6.8），使柱溫，反應(yīng)浴溫度，緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數(shù)達(dá)到預(yù)定要求，并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（5.9）進(jìn)行校準(zhǔn)。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。


　　8.1.2非有效賴氨酸


　　8.1.2.1二硝基苯化反應(yīng)


　　稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份，置于150mL燒瓶（6.5）中，加入4mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min，其間需不時(shí)振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液（5.3），加蓋，振搖，注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。


　　8.1.2.2純化


　　在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，溫度不高于40℃條件下，將上述反應(yīng)物蒸干，加入35mL乙醚（5.1），振搖或攪拌后，待固體充分沉降，棄去絕大部分乙醚，小心不要帶出固體樣品顆粒。重復(fù)上述操作兩次，每次加25mL乙醚（此步驟乙醚層有時(shí)似較渾濁，只要傾倒時(shí)不帶出樣口顆粒，可不必離心）。最后，蒸發(fā)除去殘存乙醚。


　　8.1.2.3酸水解


　　邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸（5.4），使樣品全部浸于酸中，裝好回流冷凝器，置于120～130℃油浴中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。


　　取下燒瓶，冷卻。將水解物定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水定容，過濾。吸取5mL濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，60℃左右蒸發(fā)至干，加水少許，重復(fù)蒸干1～2次。


　　將殘?jiān)苡?mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），用離心機(jī)（6.6）離心10min，取上清液上機(jī)或貯于具塞小管中冷藏備用。


　　8.1.2.4測(cè)定


　　同8.1.1.2。


　　非有效賴氨酸峰值較低，易受鄰峰或雜峰干擾，如某些氨基酸自動(dòng)分析儀該峰分離不好，需將樹脂床（或分析柱）加長(zhǎng)，或變換參數(shù)與程序。


　　8.2B法──簡(jiǎn)化法


　　8.2.1總賴氨酸


　　準(zhǔn)確稱取約含50mg粗蛋白質(zhì)的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入25mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器并置于預(yù)先熱至120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，緩緩煮沸水解24h。


　　冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液2mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，60℃濃縮至干，加水少許，重復(fù)蒸干1～2次。


　　殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），（粗蛋白質(zhì)含量為10％～20％的樣品加2mL，粗蛋白質(zhì)含量為30％～50％的加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機(jī)。


　　8.2.2非有效賴氨酸


　　8.2.2.1二硝基苯化反應(yīng)


　　稱取約含蛋白質(zhì)20～25mg的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入2mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min（其間不時(shí)振搖），加入DNFB乙醇溶液（5.3）3mL，振搖混勻后，在室溫下暗處放置過夜。


　　將上述水解管置85～90℃水浴中蒸去乙醇，直至振搖時(shí)不產(chǎn)生泡沫為止。此時(shí)水解管內(nèi)物應(yīng)失重2.5～3g。


　　8.2.2.2純化


　　于去醇后的水解管內(nèi)加入2mL乙醚（5.1），加塞，劇烈振搖后令其分層，棄去乙醚層，再用乙醚萃取兩次，每次10mL，棄去醚層后，將水解管放入60～70℃水浴，除去殘存乙醚。


　　8.2.2.3酸水解


　　邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸（5.5）裝好冷凝器，與測(cè)總賴氨酸樣品一道置120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，回流水解24h。


　　冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，加水少許，重復(fù)蒸干1～2次。


　　殘?jiān)屑尤脒m量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6）（蛋白質(zhì)含量10％～20％加3mL，30％～50％加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機(jī)。


　　9分析結(jié)果的表述


　　9.1總賴氨酸


　　樣品中總賴氨酸含量W1，以其質(zhì)量百分率表示，即：


　　……（1）


　　式中：A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量，ng；


　　m1──樣品質(zhì)量，mg；


　　D──稀釋倍數(shù)。


　　9.2非有效賴氨酸


　　樣品中非有效賴氨酸含量W2，以其質(zhì)量百分率表示，即：


　　……（2）


　　式中：A──每毫升上機(jī)液中賴氨酸含量，ng；


　　m2──非有效賴氨酸測(cè)定中樣品質(zhì)量，mg；


　　D──稀釋倍數(shù)。


　　9.3有效賴氨酸


　　樣品中有效賴氨酸含量W3，以質(zhì)量百分率表示，即：


　　有效賴氨酸W3＝W1-W2……（3）


　　若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質(zhì)量百分率表示，則


　　W3（％）＝〔（W1-W2）/W1〕×100……（4）


　　10重復(fù)性


　　同一試樣兩平行測(cè)定值的相對(duì)相差，應(yīng)不超過其平均值的10％。


　　注：與生物測(cè)定法相比，本法測(cè)定結(jié)果偏高，在分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)需加以注意。